Aurélie GAUDARD, Emmanuelle VARLET-MARIE, Michel AUDRAN, Françoise BRESSOLLE

RÉSUMÉ
L'érythropoïétine humaine recombinante (alpha et bêta) est utilisée depuis la fin des années 80 par les athlètes dans le but d'augmenter le transport d'oxygène, le pouvoir aérobie, et de ce fait la performance. D'autres molécules apparentées comme la darbépoïétine ont été détournées de leur usage médical à des fins de dopage par certains sportifs. Nous nous proposons, tout d'abord, de présenter les formes d'érythropoïétine existantes ainsi que toutes les molécules et méthodes susceptibles, à plus ou moins long terme, d'augmenter la production d'érythropoïétine ou de mimer son action. Nous exposerons, ensuite, les méthodes directes et indirectes de dépistage d'un dopage à l'érythropoïétine. Enfin, nous discuterons la pertinence de leur utilisation et leur possible application au dépistage d'un dopage par de nouvelles formes d'érythropoïétine ou par des molécules mimant son action.
Mots-clés : Dopage, méthodes de détection, érythropoïétines, mimétiques de l'érythropoïétine, génétique.

SUMMARY
Recombinant human erythropoietin (alfa and beta rHuEpo) is used by some endurance athletes to increase oxygen transport and aerobic power in an attempt to improve endurance capacity and recovery during competition. Other forms of erythropoietin such as darbepoietin are used by athletes in a purpose of doping. First, we review all forms of erythropoietins and methods susceptible of increasing erythropoietin concentration or replacing it. Then, we review all direct and indirect methods to detect erythropoietin abuse. To conclude, we discussed the pertinency of these methods and their potential application to detect new erythropoietins or mimetics.
Key-words : Doping, detection methods, erythropoietins, erythropoietin mimetics, genetic

Sarah VAUTIER, Laurent HAVARD, Jean-Pierre DUPEYRON, François CHAST

RESUME
Une jeune fille de 15 ans est admise aux urgences pour troubles du comportement, agitation et hallucinations, altérations des fonctions cognitives, troubles neurologiques et manifestations anticholinergiques importantes. L'examen psychiatrique ayant éliminé une cause psychotique, les médecins s'orientent vers une intoxication médicamenteuse, d'autant que les signes biologiques font craindre une rhabdomyolyse. Cette patiente a ingéré une pâte blanche qui sera analysée au laboratoire. Un prélèvement urinaire fera également l'objet d'un examen toxicologique.
L'analyse par chromatographie liquide haute performance couplée à un détecteur à barrette de diodes montre un pic isolé retrouvé à la fois dans les urines et la solution de poudre d'origine inconnue : temps de rétention et spectres UV identiques, permettant de conclure à la présence de doxylamine, médicament antihistaminique essentiellement utilisé pour ses propriétés sédatives.
La patiente quitte l'hôpital après 6 jours de traitement symptomatique sans complications ni séquelles neurologiques.
Cette intoxication médicamenteuse sévère liée à l'absorption d'une quantité importante de Donormyl®, spécialité en vente libre, doit éveiller l'attention des pharmaciens quant à sa dispensation à des patients tentés par un éventuel usage détourné.
Mots clés :
Anticholinergiques, Doxylamine, HPLC-BD, Intoxication médicamenteuse, Rhabdomyolyse.

SUMMARY
A 15-year old girl is admitted to emergency unit for behavior troubles, restlessness and hallucinations, cognitive, neurological and anticholinergic disturbances. Psychiatric examination being discordant with psychosis, physicians turn toward drug overdose. Patient's mother brought to the hospital a beaker, found in the girl's bedroom, containing a humid powder that looked as white paste. Part of this paste and a urine sample were analyzed. Immunochemical tests for drugs of abuse on urine sample and on an aqueous solution made with the paste were both negative.
After hydrolysis and solid-liquid extraction, urine and aqueous solution were analyzed by high performance liquid chromatography with diode array detection. A high absorbance peak was founded in the urine as well in the aqueous solution, with homologous UV spectrum. The comparison with spectrum library allowed to conclude for presence of doxylamine both in urine and in paste.
The young patient said she had bought several Donormyl (tm) boxes, without more explanations. This serious intoxication, with a low price OTC drug, may prompt pharmacists to a careful attention when delivering the drug to people at risk of misuse.
Key-words :
Doxylamine, HPLC-DAD, Anticholinergic drugs, Rhabdomyolysis, Self-poisoning.

Wafa HASSEN, Salwa ABID-ESSEFI, Abdellatif ACHOUR, Khira MAAROUFI, Edmond CREPPY, Hassen BACHA.

RESUME
L'ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine connue essentiellement pour ses effets néphrotoxiques. Des études réalisées dans les régions balkaniques ont fortement soupçonné l'OTA d'être le principal agent causal de la Néphropathie Endémique des Balkans (NEB). Cependant, malgré les nombreuses investigations réalisées, l'implication de l'OTA dans cette néphropathie humaine est encore sujette à controverse.
En Tunisie, une néphropathie interstitielle chronique (NIC) à étiologie indéterminée, similaire à la NEB, où l'OTA semble également être impliquée, a été bien caractérisée. Dans ce travail, nous nous proposons d'apporter des preuves supplémentaires impliquant davantage l'OTA dans cette néphropathie. Nous présentons le bilan d'une étude rétrospective de dix ans (1991-2001) engageant 954 néphropathes et 205 individus sains. Dans ce bilan, nous comparons les contaminations sériques en OTA dans trois groupes : un groupe d'individus sains ne présentant aucune pathologie (205 sujets), un groupe de néphropathes présentant une NIC inexpliquée (383 sujets) et un groupe de néphropathes à étiologie connue (571 sujets). La détection et le dosage de l'OTA sont réalisés après extraction à partir des échantillons sériques suivie d'une analyse par chromatographie liquide haute performance (HPLC) avec détection de fluorescence. Nous montrons que l'incidence la plus importante de la contamination sérique en OTA est trouvée dans le groupe présentant une NIC inexpliquée. En effet, dans ce groupe, le pourcentage d'individus OTA-positifs est de 97 % et il n'est que de 73 % et de 86 % respectivement chez les individus sains et chez ceux présentant d'autres néphropathies à étiologie connue. Les concentrations moyennes sont également plus élevées dans le groupe de NIC d'étiologie inconnue (50.77 ( 4.75 ng/ml) que dans les autres groupes de contrôle (2.35 ( 0.90 ng/ml) ou de néphropathes à étiologies connues (9.96 ( 3 ng/ml). Notre étude renforce davantage le rôle de l'OTA dans cette néphropathie et la désigne comme agent causal très probable.
Mots clés : Ochratoxine A, Sang, HPLC, Néphropathie Humaine, Tunisie

SUMMARY
Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin essentially known for its nephrotoxic effects. Studies performed in the Balkans pointed out OTA as the main causal agent of Balkan Endemic Nephropathy (BEN). However, despite the considerable amount of data regarding this disease, it is still controversial whether OTA plays a causative or only a subordinate role in the induction of this human nephropathy.
In Tunisia, a chronic interstitial nephropathy (CIN) of unknown cause, perfectly similar to BEN, was well characterised and wherein OTA seems to be also implicated. In this study, we tried to consolidate the suspected link between blood OTA contamination and Tunisian Chronic Interstitial Nephropathy (CIN) of unknown aetiology. Indeed, we give hereby the assessment of a 10-years retrospective study (1991-2001) including 954 nephropathy patients and 205 healthy subjects. In this survey, we have compared frequency of positive samples, the means and the range of blood OTA contamination in three groups : a group of healthy subjects with no pathology (205 subjects), a group presenting CIN of unknown cause (381 subjects) and a group with other chronic kidney disease of known cause (571 subjects). OTA detection and assay were performed after serum samples extraction followed by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis with fluorescence detection. Our results show that the highest incidence was found in CIN of unknown cause group. Indeed, in this group, the percentage of OTA-positive samples is up to 97 % whereas it is only 73 % and 86 % respectively in control and in other kidney disease groups. The mean concentrations are also highest in CIN of unknown cause group (50.77 ( 4.75 ng/ml) as opposed to controls (2.35 ( 0.90 ng/ml) and other chronic kidney diseases group (9.96 ( 3 ng/ml).
Our study emphasizes further the implication of OTA in this particular human nephropathy and underlines the probable causative role of OTA in the onset of this disease.
Key words : Ochratoxin A, Blood, HPLC, Human Nephropathy, Tunisia

Gilbert FOURNIER

RESUME
Jusqu'en 2000, la teneur limite en delta-9-THC du chanvre cultivé industriellement était fixée à 0,30%. En 2001, cette limite a été abaissée à 0,2% et le protocole d'échantillonnage a été modifié.
La présente étude rassemble les résultats de tous les dosages de delta 9-THC réalisés entre 1987 et 2001 sur les semences commercialisées par la Coopérative Centrale des Producteurs de Semences de Chanvre (CCPSC) des dix variétés de chanvre cultivées en France durant cette période (917 analyses).
La limite de 0,30% n'a jamais été atteinte. Seuls cinq résultats se sont situés entre 0,20 et 0,30%. Ils concernent tous la variété Fedora 19 dont la commercialisation a cessé en 2000.
Mots clés : Chanvre, Cannabis sativa, delta-9-tétrahydrocannabinol, dosage

SUMMARY
Until the year 2000, the maximum allowed content of delta 9-THC in hemp grown by industrial farming was 0.30 %. In 2001, this limit was lowered to 0.20 % and the sampling protocol was changed.
This study includes results of all delta 9-THC assays done between 1987 and 2001 on seeds marketed by the Coopérative Centrale des Producteurs de Semences de Chanvre (CCPSC) from ten varieties of hemp grown in France during this time (917 analyses).
The 0.30 % limit has never been reached. Only five results were between 0.20 and 0.30 %. They all concerned the Fedora 19 variety which has not been sold since 2001.
Keywords : Hemp, Cannabis sativa, delta-9-tetrahydrocannabinol, titration

Patrick MURA, Bertrand BRUNET, Carla MONZON, Yves PAPET, Gérard MAUCO.

RESUME
Le cannabis est le produit psychoactif illicite le plus consommé en France et dans de nombreux autres pays. Les effets chez l'homme sont principalement dus au (9-tétrahydrocannabinol (THC) et au 11-OH-(9-tétrahydrocannabinol (11-OH-THC) et sont responsables de nombreux problèmes de santé publique, tels que les accidents de la voie publique, les accidents du travail, le dopage ou la soumission chimique. C'est pour toutes ces raisons que le dosage des cannabinoïdes est de plus en plus pratiqué dans les laboratoires de toxicologie. Les techniques analytiques sont désormais très performantes. Les concentrations sanguines reflètent-elles le degré d'altération des fonctions cognitives et motrices d'un individu ? S'il existe une bonne corrélation entre la dose et les effets, la corrélation entre dose et concentration sanguine existe uniquement au moment du pic sanguin. En raison d'une très forte et rapide fixation tissulaire, aucune corrélation n'a été observée entre les concentrations sanguines en cannabinoïdes et les effets, qui sont à leur apogée alors que les concentrations en principes actifs sont devenues très faibles. La connaissance des concentrations sanguines en THC et/ou 11-OH-THC ne permet donc pas d'apprécier le degré d'altération des performances cognitives et motrices et la notion de seuil de dangerosité pour la concentration sanguine n'est donc pas envisageable. C'est pourquoi, dans l'attente de travaux complémentaires, la seule mise en évidence de principes actifs du cannabis dans le sang au dessus d'un seuil analytique préalablement défini permet d'affirmer que le sujet a récemment consommé du cannabis, et donc de pouvoir estimer que le sujet était sous influence de cannabis au moment du prélèvement.
Mots-clés
Cannabis, THC, concentrations sanguines, accidents, soumission chimique, interprétation.

SUMMARY
Cannabis is the major drug of abuse consumed in France as well as in many other countries. Effects in human are mainly due to (9-tetrahydrocannabinol (THC) and 11-OH-(9-tetrahydrocannabinol (11-OH-THC). These effects are involved in many public health problems such as traffic safety, workplace accidents, doping or drug facilitated assaults. Therefore, identification and determination of cannabinoids in blood is increasingly performed in toxicology laboratories. Analytical procedures are now highly efficient. Do blood concentrations of cannabinoids reflect the degree of impairment of cognitive and psychomotor performances ? Whereas a good correlation is observed between doses and effects, the correlation between doses and blood levels of cannabinoids only exists at the moment of the blood concentration peak. Because of a very quick and strong distribution in fat tissues, no correlation could be observed between blood levels of cannabinoids and the effects, which reach their maximum when blood concentrations in active analytes become very low. Consequently, blood concentrations in THC and/or 11-OH-THC do not allow the degree of impairment of cognitive and psychomotor performances to be evaluated. Consequently, the determination of a blood level risk cut-off is not scientifically conceivable. It is the reason why, looking forward to complementary studies, the unique presence of active metabolites of cannabis in blood above an analytical threshold previously defined attests of a recent use of cannabis which allows to consider that the subject was under the influence of cannabis at the moment of blood sampling.
Keywords
Cannabis, THC, blood concentrations, accidents, chemical submission, interpretation.

Anne GRUSON, Gilbert PEPIN, Pierre MARQUET, Jean-Pierre GOULLE, Michel LHERMITTE

PAS DE RESUME

Antoine TRACQUI, Laurence LE GOURRIER, Marion VILLAIN, Pascal KINTZ, Albert JAEGER, Bertrand LUDES

RESUME
Une méthode originale par HPLC/MS est proposée pour l'identification formelle et le dosage du lévétiracétam (LEV ; Keppra(r)), un nouvel antiépileptique, dans les fluides biologiques. Après micro-extraction en phase liquide de 100 µl d'échantillon par le chloroforme/2-propanol/n-heptane (25 : 10 : 65, v/v) à pH 9,5 en utilisant le prazépam comme standard interne (SI), la séparation s'effectue sur colonne Waters NovaPak C18 (150 x 2,0 mm, i.d.) à l'aide d'un gradient acétonitrile/tampon 2 mM NH4COOH, pH 3,0. La détection est assurée par le spectromètre de masse API-100 (Perkin-Elmer) avec interface à pression atmosphérique de type ionspray utilisée en mode d'ions positifs ; l'acquisition se fait en courant ionique total ou en SIM à m/z 171,0 ; 154,0 et 126,0 (LEV); et 325,0 (SI). Les temps de rétention moyens du LEV et du SI sont respectivement de 3,60 ± 0,12 min et 8,09 ± 0,27 min ; l'ensemble de la procédure d'analyse nécessite moins de 45 min. Les limites de détection pour le LEV sont comprises entre 150 et 200 µg/l, la limite de quantification est de 500 µg/l dans le sang total, le plasma ou l'urine. La méthode est simple, rapide, sensible et d'une très grande spécificité; elle est appropriée non seulement aux dosages à visée médico-légale mais aussi au monitoring thérapeutique ou à la toxicologie d'urgence. Une application clinique est présentée avec le cas d'un sujet de 66 ans supposé victime d'un surdosage en Keppra(r), chez lequel la procédure décrite a permis de caractériser un taux plasmatique à 199,5 mg/l et un taux urinaire à 413,7 mg/l.
Mots-clefs : lévétiracétam, HPLC/MS, dosage.

SUMMARY
An original method based upon HPLC/MS is presented for the identification and quantitation of levetiracetam (LEV; Keppra(r)), a novel antiepileptic agent, in biological fluids. After a liquid/liquid extraction micromethod (100 µl sample) using chloroforme/2-propanol/n-heptane (25 : 10 : 65, v/v) at pH 9.5 and prazepam as internal standard (IS), separation was performed on a Waters NovaPak C18 column (150 x 2.0 mm, i.d.), using a gradient of acetonitrile/2 mM NH4COOH buffer, pH 3.0. Detection was done by a Perkin-Elmer API-100 mass analyzer equipped with an ionspray atmospheric pressure interface, operated in the positive ionization mode. MS data were monitored in the TIC or SIM modes at m/z 171.0, 154.0 et 126.0 (LEV); and 325.0 (IS). The average retention times for LEV and the IS were 3.60 ± 0.12 min and 8.09 ± 0.27 min, respectively ; the whole analytical procedure can be achieved in less than 45 min. LODs were in the range 150-200 µg/l and the LOQ was 500 µg/l in whole blood, plasma, or urine. This method is simple, rapid, sensitive and ultraspecific; it is suitable for both medicolegal and clinical purposes, e.g. therapeutic drug monitoring. As an application, we report the case of a 66-year-old man in which an overdose of Keppra(r) was suspected; as measured by our procedure, LEV concentrations in plasma and urine were 199.5 and 413.7 mg/l, respectively.
Keywords : levetiracetam, HPLC/MS, determination.

Marion VILLAIN, Véronique DUMESTRE, Vincent CIRIMELE, Bertrand LUDES, Pascal KINTZ

Sophie ETIENNE, Vincent CIRIMELE, Bertrand LUDES, Pascal KINTZ

Recommendations for clinical informations for toxicology laboratories
Michel LAVIT, Denis LAMIABLE, Bernard CAPOLAGHI