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Annales de Toxicologie Analytique

 
Résumés du n°2, vol XVI, 2004

ISSN 0768-598X

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Quantification du thromboxane B2 par CLHP-ESI-SM. Application à des microsomes de levure exprimant la thromboxane synthase humaine
Dany CHEVALIER, Florian KLINZIG, Luc HUMBERT, Christelle CAUFFIEZ, Jean-Marc LO-GUIDICE, Delphine ALLORGE, Bernard CARTIGNY, Michel IMBENOTTE, Franck BROLY, Michel LHERMITTE

Le but de cette étude était de mettre au point une méthode rapide, sensible et spécifique de quantification du thromboxane B2 (TXB2) par chromatographie liquide haute performance couplée à une interface d'ionisation électrospray et à une détection par spectrométrie de masse (CLHP-ESI-SM), à partir de microsomes de levure exprimant la thromboxane synthase (CYP5A1) humaine. Ce métabolite est le produit d'hydratation stable du thromboxane A2 (TXA2) produit par le CYP5A1 à partir de son substrat, la prostaglandine H2 (PGH2). La quantification du TXB2 a été réalisée à l'aide d'un standard interne deutéré, le 6-céto-PGF1?-d4, ajouté avant une extraction par le diéthyléther. La séparation chromatographique s'effectue en phase inverse sur colonne XTerra MS C18. L'élution est réalisée en mode isocratique (60 % acétonitrile contenant 0,05 % d'acide formique - 40 % tampon formiate d'ammonium 5 mM, pH 3,0). Le mode d'ionisation électrospray négatif a été retenu pour une meilleure détection du TXB2 et du 6-céto-PGF1?-d4. Cette technique appliquée avec succès aux microsomes exprimant le CYP5A1 sauvage montre une production croissante et linéaire de TXB2 pour la gamme de concentrations de PGH2 utilisée (0-120 µM). Cette méthode pourra être appliquée à l'analyse de l'activité enzymatique de nouveaux variants de la thromboxane synthase, récemment mis en évidence au laboratoire, et exprimés dans des microsomes de levure.

LC-ESI-MS quantification of thromboxane B2 in yeast microsomes expressing human thromboxane synthase
Dany CHEVALIER, Florian KLINZIG, Luc HUMBERT, Christelle CAUFFIEZ, Jean-Marc LO-GUIDICE, Delphine ALLORGE, Bernard CARTIGNY, Michel IMBENOTTE, Franck BROLY, Michel LHERMITTE
An LC-ESI-MS method for specific, sensitive and rapid quantitative analysis of thromboxane B2 (TXB2) in yeast microsomes expressing human thromboxane synthase (CYP5A1) was developed. TXB2 is a stable, biologically inert metabolite formed from the non-enzymatic hydrolysis of TXA2, which is produced by thromboxane synthase (CYP5A1) from prostaglandin H2 (PGH2). TXB2 was quantified after addition of 6-céto-PGF1?-d4 as an internal standard, by liquid phase extraction using diethylether and reverse phase LC-ESI-MS. HPLC/MS analysis was performed with a column C18 XTerra using a mobile phase (60 % acetonitrile with 0.05 % formic acid - 40 % ammonium formiate 5 mM, pH 3.0). The LC system used ion spray interface with MS system in negative ion detection and selected ion recording mode. The method was successfully applied to yeast microsomes expressing human CYP5A1 incubated with PGH2, and TXB2 production appears to be linear for PGH2 concentrations ranging from 0 to 120 µM. This method could be used for the kinetic analysis of new CYP5A1 variants expressed in yeast microsomes, recently identified in our laboratory.

Stratégie de validation de méthodes de dosage en bioanalyse en vue d'études pharmacocinétiques et toxicologiques
Olivier NICOLAS, Christine FARENC, Françoise BRESSOLLE
Lors des études de pharmacocinétiques, toxicocinétiques et lors du suivi thérapeutique des patients, il est important d'utiliser une méthode analytique correctement validée pour obtenir des résultats fiables qui pourront être ainsi interprétés de façon satisfaisante. Dans ce manuscrit les différentes étapes de la validation sont développées ; leurs buts étant de démontrer la fiabilité des résultats à la fois pour les principes actifs et les métabolites. A cet effet, les problèmes liés à la qualification de l'équipement analytique et au pré-traitement de l'échantillon (effet matrice) seront abordés. Les critères de validation comprennent la spécificité, la fidélité, l'exactitude, la linéarité, les seuils de quantification et de détection, la robustesse mais aussi tous les essais de stabilité.

A strategy for validation of bioanalytical methods to support pharmacokinetic and toxicological studies
Olivier NICOLAS, Christine FARENC, Françoise BRESSOLLE
Validations of analytical methods are important for the generation of data for pharmacokinetics, toxicokinetics and during therapeutic drug monitoring. It is essential to use well defined and fully validated analytical methods to obtain reliable results that can be satisfactorily interpreted. This manuscript is intended to provide guiding principles for the evaluation of a method's overall performance. For this purpose, problems due to instrument qualification and to sample pretreatment (matrix effect) are considered. The criteria considered are as follows: selectivity, accuracy, precision, linearity, recovery, limits of quantitation and of detection, ruggedness and stability essays.

Santhica 23 et 27 : deux variétés de chanvre (Cannabis sativa L.) sans D-9-THC
 Gilbert FOURNIER, Olivier BEHEREC, Sylvestre BERTUCELLI
Le cannabigérol (CBG) est le précurseur biogénétique de tous les autres cannabinoïdes, substances spécifiques du chanvre. En 1987 a été identifié pour la première fois en France un nouveau chimiotype dont le CBG est le cannabinoïde majoritaire. Les teneurs de cette substance évoluent au cours du développement de la plante pour atteindre un maximum lors de la fin de la floraison. Au cours de la même période le D-9-tétrahydrocannabinol (D-9-THC) n'a pas été retrouvé. La biogenèse des cannabinoïdes semble donc s'être précocement arrêtée. Deux nouvelles variétés (Santhica 23 et 27) présentant ce profil cannabinoïdique ont été créées. Ne renfermant pas de D-9-THC, elles ne présentent aucune propriété psychotrope. Il est proposé de les considérer comme des " variétés à fibres de seconde génération ".

Santhica 23 and 27 : two varieties of hemp (Cannabis sativa L.) without D-9-THC
Gilbert FOURNIER, Olivier BEHEREC, Sylvestre BERTUCELLI
Cannabigerol (CBG) is the biogenetic precursor of all the others cannabinoids, specific substances of hemp. In 1987, a new chemotype whose CBG is the dominant cannabinoïde, was identified for the first time in France. The amount of this substance increases during the development of the plant to reach a maximum at the time of the end of flowering. During the same period the D-9-tetrahydrocannabinol (D-9-THC) was not found. The biogenesis of the cannabinoids seems to have stopped precociously. Two new varieties (Santhica 23 and 27) presenting this cannabinoidic profile were created. Not containing D-9-THC, they do not present any psychotropic properties. It is proposed to regard them as "second generation varieties of fibres".

GHB dans le sang post-mortem. Critères d'interprétation
Pascal KINTZ, Marion VILLAIN, Carole JAMEY, Vincent CIRIMELE, Antoine TRACQUI, Bertrand LUDES
Il est désormais admis par la communauté scientifique que du GHB peut être retrouvé dans le sang post-mortem en absence de toute exposition à ce stupéfiant. Dans ces conditions, un seuil analytique de positivité a été proposé à 50 mg/l dans le sang. Afin de valider ce seuil, 73 échantillons de sang cardiaque post-mortem, obtenus lors d'autopsies où le médecin légiste a pu exclure tout lien avec le GHB, ont été analysés par GC/MS après précipitation. Le délai entre le décès et l'autopsie a varié entre 12 et 72 heures. En parallèle, lorsque cela était possible, du sang périphérique, de la bile et de l'humeur vitrée ont été également analysés. Il a été retrouvé du GHB dans tous les échantillons de sang cardiaque, avec des concentrations variant de 0,4 à 409 mg/l. Une concentration supérieure à 50 mg/l a été observée dans 16 cas. Les examens complémentaires, avec les autres prélèvements correspondants, ont donné les résultats suivants : - sang cardiaque (51 à 409 mg/l) versus sang périphérique (1,6 à 44 mg/l) dans 6 cas - sang cardiaque (55 à 409 mg/l) versus bile (6 à 238 mg/l) dans 9 cas - sang cardiaque (51 à 409 mg/l) versus humeur vitrée (4 à 21 mg/l) dans 7 cas Il apparaît que l'application stricte d'un seuil de positivité dans le sang à 50 mg/l ne permet pas d'interpréter correctement les données analytiques. La bile ne semble pas d'un intérêt discriminant et seuls le sang périphérique, mais surtout l'humeur vitrée permettent de documenter au mieux les résultats. Il est essentiel de confirmer toute concentration de GHB supérieure à 50 mg/l dans le sang cardiaque par une détermination concomitante dans le sang périphérique et l'humeur vitrée. L'urine pouvant également contenir des concentrations importantes de GHB, n'apporte pas d'information complémentaire. Des travaux sont en cours pour confirmer l'intérêt de la détermination du rapport isotopique 12C/13C (comme pour la testostérone) pour différencier un usage exogène d'une formation endogène.

Interpretation of postmortem GHB concentrations
Pascal KINTZ, Marion VILLAIN, Carole JAMEY, Vincent CIRIMELE, Antoine TRACQUI, Bertrand LUDES
Since GHB is present in both blood and urine of the general population as an endogenous compound, toxicologists must be able to discriminate between these endogenous levels and a concentration resulting from exogenous exposure. To verify the accuracy of a proposed 50 mg/L postmortem blood cut-off, we tested 73 autopsy cases of subjects where the cause of death could exclude GHB exposure. The delay between death and autopsy ranged from 12 to 72 hours. GHB was tested by GC/MS after precipitation. Briefly, 20 µL blood, bile, or vitreous humor were pipetted in a glass tube, followed by 20 µl GHB-d6 and 45 µL acetonitrile. After vortexing and centrifugation, the supernatant was collected and evaporated to dryness. The residue was derivatized with BSTFA with 1% TMCS for 20 min at 70 °C. GHB (m/z 233, 204 and 147) and GHB-d6 (m/z 239) were identified by MS. GHB tested positive in all the 73 whole blood (cardiac) specimens, with concentrations in the range 0.4 to 409 mg/l, with a major distribution in the range 10-40 mg/l. A concentration > 50 mg/l was observed in 16 cases. As there was no data to support GHB exposure, this was considered as postmortem formation. In order to discriminate this contamination, when available, femoral blood, bile or/and vitreous humor were tested. The following results were obtained : - cardiac bood (55 to 409 mg/l) versus bile (6 to 238 mg/l) in 9 cases; - cardiac blood (51 to 409 mg/l) versus femoral blood (2 to 44) in 6 cases, and - cardiac blood (51 to 409 mg/l) versus vitreous humor (4 to 21) in 7 cases. It is obvious that bile does not fit the requirements for discrimination and that femoral blood and mostly vitreous humor can be of particular interest. These results demonstrate that a positive (> 50 mg/l) postmortem blood GHB concentration cannot support alone drug exposure and that it is essential to document the case with other specimens , including peripheral blood and vitreous humor.