I. Les nouvelles technologies en toxicologie médico-légale.

M. Bogusz (Aix la Chapelle, Allemagne p 32) a présenté les dernières évolutions analytiques et a montré leur intérêt dans certaines applications médico-légales. Ainsi au cours de cette présentation, un grand nombre d’innovations (de la préparation de l’échantillon à la détection) ont été décrites :

    1) la préparation de l’échantillon par :

- extraction sur support solide (SPE)

    2) la séparation par :

- chromatographie planaire couplée à différents détecteurs (SM, IR ou BD) et à d’autres systèmes chromatographiques (OPTLC ou CPG)
- chromatographie en fluide supercritique (SFC) couplée à une détection SM, BD, UV.
- chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (quadripôle, TOF) et ionisation par ESI et APCI.
- chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse
- chromatographie de surface

   3) l’analyse directe comme les :

- biosensors CALICS qui s’avèrent très efficaces pour le dosage du salbutamol

Le but était donc de montrer l’intérêt et les potentialités des nouvelles techniques analytiques, à travers des exemples d’application.

            Les communications suivantes montrent les performances de méthodes de screening utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC/MS) :

Thierry Gougnard (Liège, Belgique p33) a présenté une méthode de screening toxicologique par HPLC-ESI-MS/MS.

Cette méthode de screening toxicologique permet l’identification de molécules et de leurs métabolites avec une bibliothèque contenant approximativement 200 spectres de masse de références. L’identification est réalisée avec un couplage GC/MS équipé d’une trappe d’ions. Cependant, la fragmentation induite par collision (Collision Induced Dissociation), et le calibrage de l’appareil (avec le benzylpyridium) restent difficiles à contrôler avec ce type de système. En effet, des variations de la fragmentation ont été observées notamment pour l’imipramine. Toutefois, les résultats obtenus avec le prazépam, l’halopéridol, l’acénocoumarol, le sécobarbital ont montré l’efficacité de cette procédure de screening LC/MS.

Une méthode de screening de 17 antihistaminiques dans le sang par LC-ESI-MS/MS a été présentée par M. Gergov (Helsinki, Finlande).p 35

La méthode LC/MS/MS présentée par M. Gergov permet, dans une même procédure, la recherche et le dosage dans le sang de 17 antihistaminiques. Une méthode d’extraction liquide/liquide permet d’extraire, en deux étapes successives, les antihistaminiques basiques et acides. La séparation des molécules est effectuée sur une colonne C₁₈ avec un gradient rapide (de 5 min). Le spectromètre de masse en tandem utilisé est équipé d’une source Turbo-ionspray. Les molécules sont identifiées à la fois par leur temps de rétention et par trois ions caractéristiques (un ion pseudomoléculaire et deux fragments de confirmation). La détection est réalisée en mode positif par fragmentométrie (Multiple Reaction Monitoring). Les résultats de validation et quelques cas réels nous ont été rapportés. Par ailleurs, cette méthode va permettre l’étude sur 4 ans des effets des antihistaminiques sur les accidents de la route.

Une communication sur la collision induite dans la source (CID) en LC/MS :  molécules de référence pour une bibliothèque de spectres de masse, a été présentée par W. Weinmann (Freiburg, Allemagne).p36

Dans les travaux publiés, les bibliothèques ont été construites à l’aide de couplages LC/MS équipés de simples ou de triples quadripôles et de sources d’ionisation ionspray^â (ESI) ou de nébuliseur chauffé (APCI). Les bibliothèques de spectres ont été constituées à différentes tensions d’orifice pour favoriser la fragmentation. Les domaines d’applications de ces bibliothèques concernent essentiellement la clinique, la toxicologie médico-légale et environnementale.

W. Weinmann a montré que des molécules de faible poids moléculaire pouvaient servir de références pour le réglage standard des conditions de fragmentation dans la source. Les résultats présentés montrent l’influence de la tension d’orifice sur la fragmentation de l’halopéridol, du paracétamol, du triméthobenzamide, du métronidazole et du métamizole.

En conclusion, l’utilisation de produits de référence peut permettre de contrôler les mécanismes de collision dans la source et ainsi d’identifier les molécules en toxicologie médico-légale avec une haute reproductibilité.

Une communication sur la mise au point rapide de méthodes analytiques par LC-APCI-MS en utilisant l’injection en flux continu (Flow Injection Analysis) a été présentée par W. Lechowicz (Cracovie, Pologne).p37  

Selon W. Lechowicz, le réglage optimum en injection en flux continu (FIA) des paramètres d’analyse en ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI), permet de diminuer le temps de l’optimisation. Ces résultats montrent en effet que les principaux paramètres de réglage en APCI, comme la tension d’orifice, la température de vaporisation et la tension de la sonde d’ionisation, doivent être optimisés en FIA. Par ailleurs la tension de décharge (par effet corona), la température, le flux et la pression du gaz de nébulisation, ont une faible influence sur la sensibilité. Des essais d’optimisation sur le THC, le LSD, la psilocyne et la MDMA ont été présentés. D’autres observations sur plusieurs benzodiazépines montrent l’intérêt d’optimiser la fragmentation en réglant la tension de fragmentation.

Cependant, l’intérêt de cette communication reste limité car le mode FIA est déjà couramment utilisé pour l’optimisation des réglages des conditions d’ionisation en ESI et en APCI.

U. Demme (Iena,  Allemagne) p 38 a tenté de montrer le pouvoir discriminant (DP) comme outil idéal pour l’analyse toxicologique systématique avec un GC/MS équipé d’une trappe d’ions.

Dans cette communication, U. Demme a montré l’utilité d’un paramètre comme le pouvoir discriminant (DP) dans l’analyse toxicologique systématique (STA). Le DP peut être calculé à partir du temps de rétention, de la largeur des pics et de la réponse analytique des substances. Néanmoins, le risque de croisement possible au niveau de la trappe d’ions a été étudié et discuté. Des comparaisons ont été effectuées entre les spectres obtenus et les spectres de masse de référence disponibles dans les bibliothèques commercialisées (Pfleger-Maurer-Weber).

Ainsi, plus de 300 spectres de masse avec leur temps de rétention respectif ont pu être enregistrés dans la base de donnée essentiellement à partir d’échantillons urinaires. Après un simple traitement de l’échantillon urinaire, cette procédure automatique (utilisant un GC/MS à trappe d’ions) s’avère plus efficace en analyse toxicologique que d’autres techniques automatiques comme le système HPLC-REMEDI. L’inconvénient de cette technique réside dans le fait que la fragmentation varie à haute concentration pour certaines molécules ; ce qui peut être à l’origine d’erreurs d’identification.

 L’identification des impuretés dans la méthamphétamine illicite par GC/MS et GC/MS-MS en Corée présentée par Mme Chung et coll.(p 38)

Le dioctylsebacate est utilisé comme étalon interne. La N-méthyl-1-phénylpropanamine, l’amphétamine, la chloroéphédrine, l’éphédrine, la 1,2-diméthyl-3-phénylaziridine, la diméthylamphétamine, la phenmétrazine, la méthamphétamine acétylée et la benzylméthylphénétylamine ont été identifiés dans les échantillons ainsi que des isomères optiques de la chloroéphédrine et de la 1,2-diméthyl-3-phénylaziridine.

L’identification de ces impuretés permet de différencier des échantillons.

            Application de la spectrométrie de masse à ionisation de surface à la toxicologie criminalistique a été présentée par A. ISHII Nagoya, Japon. p39

L’ionisation de surface est un procédé dans lequel des composés organiques, spécialement des amines tertiaires, sont ionisées sur du métal incandescent. SIOMS (Surface ionization organic mass spectrometry). Des essais ont été réalisés sur la phencyclidine. Le bruit de fond est plus faible que par IE (Impact électronique). La sensitivité est meilleure pour la pentazocine, la péthidine, les antidépresseurs tricycliques (ADT).

 La détermination des Cyanures dans les tissus par HS-GC/MS a été présentée par WENNIG (Luxembourg). (P : 40) L’HCN libéré après incubation 60’ à 60° avec de l’ acide phosphorique est transformé en CNCl par action de la chloramine T. Le N butanol est utilisé comme SI. LOD : 0,1 mg/l ; LOQ : 0,4 mg/l. cf. également  Odoul et Coll. dans le JAT 18 ; 205 – 207 ( 1994), ou  Pierre Marquet. et Coll. dans le JAT 20, 134 - 138 ; 1996.

La détermination du midazolam dans le plasma par SPME et GC-MS a été présentée par G. Frison et Coll. (Padoue, Italie).p 41.

Après déprotéinisation à l’acide perchlorique et addition de pinazépam comme étalon interne l’extraction se fait par SPME. Des essais ont été réalisés pour améliorer la SPME par le choix de la taille et du type de fibres, du sel du tampon, du pH, du temps d’absorption, la localisation dans l’injecteur… La limite de quantification est de 1 ng/ml. La fibre est réutilisée à peu près 50 fois.

 L’extraction sanguine de nombreux produits par une seule colonne SPE a été présentée par Mme Azzin et Coll. (Le Caire – Egypte(p : 42).           

Les travaux ont été motivés par le fait que les échantillons prélevés sur des enfants étaient souvent de petit volume. Des essais ont été réalisés sur Bond Elute Certify II et Abselut Colonnes. L’élution se fait en 2 temps : par l’Acétone/Chloroforme 1/1 pour les produits acides et neutres et Acétate d’éthyle/Ammoniaque  2 % (v/v) pour les produits basiques.

Bond Elute certify donne de meilleurs résultats, des résultats plus clairs. Les temps de préparation sont  de 20’ pour Abselut, de 30’ pour Bond Elut.

 L’évaluation de l’électrophorèse capillaire (CE) pour le screening de drogues dans les matrices biologiques a été présentée par Mme M. Boone et Coll. de Groningen Pays Bas (p 43).

Ont été testés les

- CZE : Capillaire Zone Electrophorèse
- MEKC : Micellar electroKinetic Chromatography
- NACE : Non Aqueous Capillary electrophoresis : migration d’analytes chargés dans un électrolyte non chargé

La limite  de détection est à peu près égale à 100 ng/ml

 La détermination de produits psychopharmaceutiques et stimulants par TR-FIA : “ time resolved fluoroimmunoassay ” est présenté par Mme KIMORA  et Coll Tokyo Japon (p 44).

Il s’agit d’une immunoanalyse basée sur le fait que l’Europium, le Samarium et le Terbium chelatés ont une forte fluorescence et une vie longue. Ils peuvent être utilisés pour marquer en TR-FIA. Une compétition antigène anticorps est mesurée.